二氧化碳培養箱滅菌方法

二氧化碳培養箱水托盤加硫酸銅方法

  配制方法：20g無水硫酸銅＋5ml濃硫酸＋1L高壓過的雙蒸水

  配制飽和硫酸銅溶液 

 細胞間*消毒

       1．熏蒸無菌間，甲醛加高錳酸鉀即可，一般72小時后開門通氣。

       2．用0.5%新潔爾滅擦拭超凈臺和墻壁，確保不留死角，地面用新潔爾滅消毒液拖地。

       3．75%酒精對無菌間的所有物品進行消毒，包括孵箱內。

       4．紫外燈，空氣凈化器打開至少4h以上，紫外燈可以過夜。

       目前，控制水盤內污染的方法有如下幾種：

       1、 定期(至少每兩周一次)，更換水盤內的無菌蒸餾水或無菌去離子水。

       2、 在水盤內添加適量硫酸銅，配制方法：20g無水硫酸銅＋5ml濃硫酸＋1L滅菌純水。

       3、 夏季氣溫高時，水盤里加0.02％的疊氮鈉可以有效的預防真菌污染。

       4、 水盤內添加適量抗生素。

       5、 定期為二氧化碳培養箱（含水盤）進行一次高溫滅菌。

       對付霉菌通常用飽和的硫酸銅溶液，放在培養箱的裝水盤中，細胞房的空調要用除濕的功能。如果不幸染上，要用84液擦培養箱，再用75%酒精擦。

 滅菌操作：

 在無菌箱內每立方米用甲醛8—10毫升，高錳酸鉀5克，熏蒸45分鐘后接種

 在無菌箱中每立方米用甲醛8－10毫升、高錳酸鉀0.25千克，熏蒸45分鐘后接種，栽培種接種量按每瓶二級種接30－40袋為宜。

 （一）常用消毒劑

       現將常用的藥品及其配制、使用方法，介紹如下：

    1． 35％甲醛水溶液（HCHO）：又名福爾馬林，使蛋白質變性。用于培養室、無菌室的滅菌。

 　2．0.1％的升泵水（HgCL3）：能使蛋白質變性，抑制酶類。0.1％升泵配制方法是稱取升泵0.1克，    用少許酒精溶解，再加水至100毫升即成。用于無菌箱、二氧化碳培養箱、培養皿四周表面以及手指的滅菌。

　3．石炭酸（C6H5OH），5％濃度噴霧后，能使蛋白變性沉淀。石炭酸（苯酚）50毫升，加水950毫升配成。用于 工作服、實驗桌的滅菌。殺菌效果同升泵。

4．高錳酸鉀（KMnO4）：氧化劑。0.1％濃度能使蛋白質與氨基酸氧化，失去酶的活性，用于消毒，能抑制或殺死 雜菌。

　5．乙醇（CH3CH3OH）：又稱酒精。消毒以75％濃度的效果好。它能使蛋白質脫水變性。高濃度酒精會使蛋白質很快脫水凝固，消毒作用反而減弱。

　 6．新潔爾滅：0.25％新潔爾滅用于無菌箱、無菌室的滅菌。一般新潔爾滅5％原液50毫升；加水950毫升配成。

　7．漂白粉水：取漂白粉10克，加水140毫升配成。通常在使用前臨時配制，靜置1～2小時，取上清液噴射，進 行室內消毒，每平方米用1升。

　8．藥皂：煤酚皂、硼酸皂等各種藥皂的水溶液，均可用于器具、橡皮塞及手指的消毒。

 9．2％硫酸銅溶液：用硫酸銅（膽礬）2克，加水至 100毫升加熱溶解配成。用于床架、木架等各種菌種架的消 毒。還可用5％硫酸銅溶液。

10．0.5％波爾多液：先用硫酸銅1斤，溶于100斤水， 再用石灰1斤，加水100斤。然后等量混合起來即成。用于菌種架、段木的消毒。

 11.多菌靈：用于殺滅真菌、半知茵。1：800倍拌料或 1：500倍噴灑均可。

       （二）無菌箱及無菌室的消毒滅菌

       無菌箱的消毒滅菌，可采取以下幾種方法：

       1．用甲醛和高錳酸鉀混合熏蒸：一般每平方米需40％甲醛10毫升、高錳酸鉀8毫升，進行熏蒸。使用時，先密閉門窗，量甲醛溶液盛入容器中、然后倒入量好的高錳酸鉀，人員隨之離開接種室，關緊房門，熏蒸20—30分鐘即可。

       2．0.1％升泵水消毒：用0.1％升泵水浸過的紗布或海綿進行指擦，或用噴霧器噴霧滅菌，使箱內的上下左右都沾上升泵水，手也可用升泵水消毒，并把袖子卷起來。噴霧后 20～30分鐘，箱內的雜菌和霧滴一起落到箱底被殺死，內部的空氣就變得很清潔。

　　 3．紫外線照射滅菌：在無菌箱中裝一支200伏、3O瓦的紫外線燈管；每次開20～30分鐘，就能達到空間殺菌的 目的。照射結束后，罩黑布半小時，以增強殺菌效果。

　　 4．石炭酸噴霧：在每次接種之前，用5％石炭酸溶液噴霧，可促使空氣中的微粒和雜菌沉降，防止桌面微塵飛揚，并有殺菌作用。

　　 5．石灰揩擦：經常用藥物熏蒸，易造成酸性環境，特別用甲醛和高錳酸鉀熏蒸長久，污染往往越來越嚴重，預防辦法可把各種藥品交替使用，過一段時間（約五周）用石灰擦洗一遍。實踐證明，這樣做效果很好。

 無菌室消毒同無菌箱。

      三）無菌室的使用規程

　　 無菌室無固定程序，但按一般操作應遵循如下規程：

　   1．接種室內和緩沖室內使用前，用5％石炭酸溶液噴霧。把所需要的器材搬入緩沖室清洗，等曬干后搬入接種 室，打開紫外線燈，照射殺菌。

　　2．穿上工作服及無菌工作帽、鞋，然后用煤皂液洗手2 分鐘。進人接種室后，查驗器械是否放在一定位置。然后用 5％石炭酸溶液重點在工作臺的上方和附近的地面上噴霧。然后退回緩沖室。還可給接種室門口地面灑一層石灰，進門時踩石灰可使鞋底保持無雜菌狀態。

　    3．接種操作前，用70％的酒精棉球擦手。進行無菌操作時，要嚴格認真，動作輕捷，盡量減少空氣流動。

　　 4．工作結束后，立即將臺面收拾干凈，不留殘物。然后用5％石炭酸全面噴灑。

　　5．操作時，注意安全。如棉塞著火，用手緊握即可熄滅。如打破菌瓶，可用抹布沾5％石炭酸，收拾到廢物桶 內。每次的污染物應小心放在盤內，蓋嚴拿出室外深埋或燒掉。

　　（四）無菌室空氣污染情況的檢驗

　　 定期檢驗無菌室空氣污染情況，對改進滅菌措施，提高成品率是非常必要的。常用方法步驟如下：

　　 1．平板檢驗法：用常規培養基，倒成平板，收入接種室。在事先熏蒸好的接種室，使用前半小時或1小時把供試的培養皿或試管打開，按預定時間蓋好培養皿或試管。留對照皿不打開。然后一起放入30℃的溫箱中培養48小時，檢查有無菌殖生長，并由菌落形態，判斷雜菌種類。一般要求平板培養基開蓋5分鐘，菌落不超過3個；敘面培養基開塞 30分鐘者，以不出現菌落為合格。

　　 2．斜面檢驗法：將常用的瓊脂斜面培養基各取二管， 放入接種室，按無菌操作各將其中的一管的棉塞取出，放在滅菌的培養皿內。經過一定時間后，再將棉塞通過火焰，塞回試管，連同對照一起培養。經48小時后，檢驗無雜菌生長。和上邊方法同。

　　 3．空氣污染情況檢驗：在接種過程中，人員的出過、器材的搬放、接種操作的動作等原因造成空氣污染，檢驗方法是在準備工作結束后，接種操作開始時，按上述方法打開培養皿蓋子或試管塞，經5分鐘、30分鐘或直到工作結束時再蓋好，以檢驗在不同的使用時間內，空氣污染的程度。

　　 如霉菌較多時；可先用5％石炭酸全面噴射后，再用甲醛熏蒸。如細菌較多時，可采取用乳酸和甲醛交替熏蒸的辦法加以殺滅。